Преподобный Нил Столобенский родился в семье крестьянина в небольшом селении Новгородской епархии. В 1505 году он принял монашество в обители преподобного Саввы Крыпецкого близ Пскова.
После 10 лет подвижнической жизни в киновии удалился на реку Серемлю, в сторону города Осташкова, где 13 лет вел строгую аскетическую жизнь в непрерывной брани с кознями диавола, которые выражались в явлениях призраков — гадов и диких зверей. Многие жители из окрестных мест стали приходить к преподобному за наставлениями, но он стал этим тяготиться и молил Бога указать ему место для подвига безмолвия. Однажды после долгой молитвы он услышал голос: «Нил! Иди на озеро Селигер. Там на острове Столобенском ты можешь спастись!» От приходивших к нему людей преподобный Нил узнал, где находится озеро, и, придя туда, был поражен его красотой. В середине озера — покрытый густым лесом остров; на нем преподобный нашел небольшую гору и выкопал пещеру, а спустя некоторое время построил хижину, в которой и прожил 26 лет. Подвиги строгого постничества и безмолвия сопровождал еще и другим, особенным подвигом — никогда не ложился спать, а позволял себе лишь легкую дремоту, опираясь на крюки, вделанные в стену келлии.
Богоугодная жизнь преподобного много раз возбуждала зависть врага, которая проявлялась через злобу местных жителей. Однажды кто-то поджег лес на острове, где стояла хижина преподобного, но пламя, дойдя до горы, чудесным образом угасло. В другой раз в хижину ворвались грабители. Преподобный сказал им: «Все мое сокровище в углу кельи». Там стояла икона Богоматери. Разбойники стали искать деньги и ослепли. Тогда в слезах раскаяния стали они молить святого о прощении. Известны и многие другие чудеса, совершенные преподобным. Он безмолвно отказывался от приношений, если совесть у приходивших к нему была нечиста или они находились в нечистоте телесной.
В предчувствии кончины преподобный Нил приготовил себе гроб. А к самому времени преставления прибыл на остров игумен одного из близлежавших монастырей и приобщил его Святых Таин. По уходе игумена преподобный Нил в последний раз совершил молитву, окадил святые иконы и келью и предал Господу бессмертную свою душу 7 декабря 1554 года.
После кончины преподобного Нила на остров Столобный приходили иноки из разных монастырей, странствовавшие по святым местам, и жили в его келье некоторое время. Игуменом Антонием и иноком Германом над могилой преподобного была устроена гробница, у которой еще до основания обители совершались исцеления болящих. Около 1590 года инок Герман поселился на острове, где в то время жил странник Борис Холмогорец. По благословению митрополита Новгородского Александра (1576-1591) они построили деревянный храм в честь Богоявления с приделом во имя блаженного Василия, Христа ради юродивого, Московского чудотворца (+ 1557).
Вскоре возникла обитель с общежительным уставом, получившая название Ниловой пустыни. Первым настоятелем ее был иеромонах Герман.
В 1595 году монахи-иконописцы Тверского Оршина Вознесенского монастыря Иов и Нифонт написали образ преподобного Нила, который был возложен на гробницу преподобного. В 1598-1600 годах Филофей (Пирогов), инок Гефсиманского скита Троице-Сергиевого монастыря, составил стихиры и канон святому и написал его житие.
В 1665 году в монастыре произошел пожар, сгорели все деревянные строения, в том числе и храм. Для совершения богослужений была построена временная деревянная церковь, а 27 мая 1667 года над гробницей преподобного Нила был заложен новый каменный храм. Во время копания рвов для храма земля осыпалась, обнажив гроб; таким образом были обретены нетленные и благоуханные мощи преподобного Нила. По благословению митрополита Новгородского Питирима в этот день было установлено ежегодное празднование обретения святых мощей преподобного Нила. Чудотворные мощи его были переложены в новую гробницу и поставлены в деревянном Покровском храме. 30 октября 1669 года в новом каменном храме были освящены приделы во имя святого апостола Иоанна Богослова и блаженного Василия, Христа ради юродивого. Святые мощи преподобного Нила поставили в первом приделе, а 9 апреля 1671 года перенесли их в главный Богоявленский храм (после его освящения). С 17 мая 1756 года ежегодно стало совершаться торжественное обнесение святых мощей вокруг монастыря, позднее — крестный ход из города Осташкова. Сохранилось описание многочисленных исцелений, совершившихся у гробницы преподобного Нила по его святым молитвам.
Святые мощи прп. Нила до 1920-х годов находились в Нило-Столобенской пустыни. Затем они попали в музей атеизма, который размещался в Вознесенском соборе Осташковского Знаменского монастыря.
При возвращении собора Церкви в 1940-х годах мощи были обретены и находились там до середины 1990-х годов, затем они были торжественно, при участии Патриарха Алексия II, перенесены в Богоявленский собор Нило-Столобенской пустыни, где находятся и поныне.